1、環(huán)境要清潔，進行無菌操作前半小時，須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動，防止塵埃飛揚。治療室應(yīng)每天用紫外線消毒一次。 

  2、進行無菌操作時，衣帽穿戴要整潔。帽子要把全部頭發(fā)遮蓋，口罩須遮住口鼻，并修剪指甲、洗手。 

  3、無菌物品與非無菌物品應(yīng)分別放置。無菌物品不可暴露在空氣中，必須放于無菌包或無菌容器內(nèi)，無菌物品一經(jīng)使用后，必須再經(jīng)滅菌處理后方可使用。從無菌容器中取出的無菌物品，雖未使用，也不可放回無菌容器內(nèi)。 

  4、無菌包應(yīng)注明物品的名稱、消毒滅菌日期，并按日期先后順序排放，以便取用，放在固定的地方。無菌包在未污染的情況下，可保存7-14天，過期應(yīng)重新滅菌。   5、取無菌物品時，必須用無菌持物鉗（鑷）。未經(jīng)消毒的用物不可觸及無菌物或跨越無菌區(qū)。 

  6、進行無菌操作時，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，應(yīng)更換或重新滅菌。 

  7、一份無菌物品，只能供一個病員使用，以免發(fā)生交叉感染。 無菌操作注意事項： 

1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %  ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每  次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間  污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間  隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。  

2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可  

以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦  拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操  作。  

3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打  

開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，  盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。  

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病

毒  

感染之細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(**少Class II)。操作過程  中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。  5. 定期檢測下列項目：  5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力  

5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。  5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300  小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。  

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水 植物外植體消毒和接種： 

用于進行組織培養(yǎng)的組織、器官和細胞稱為外植體。在組織培養(yǎng)中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進行表面消毒，這是取得培養(yǎng)成功的**基本的和重要的前提。常用消毒劑對外植體進行消毒。從室外取的材料，一般先用自來水沖洗數(shù)分鐘，對表面不光滑或長有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，自來水沖洗的時間要長，幾個小時或過夜，并且用洗衣粉或洗潔精洗滌，必要時用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后，要用無菌水洗滌3～5 遍，**后用無菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達到消毒目的，又不能損傷植物組織和細胞，還要符合就地取材的原則。對一些容易污染、較難滅菌的外植體進行表面消毒時，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般，shou先用75％乙醇浸泡外植體數(shù)秒鐘**30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無菌水洗滌。有時在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后，用無菌水洗，進一步剝?nèi)讓咏M織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無菌水漂洗3 次后，切割、用于接種。 

用消毒劑對接種材料進行滅菌處理時，可以在滅菌溶液中加入1～2 滴表面活性劑，如吐溫80或吐溫20，它們可以濕潤外植體整個組織，促進滅菌液充分接觸表面組織，達到較好的消毒效果。有時還可以用磁力攪拌、超聲振動等方法使消毒殺菌劑進入外植體。消毒溶液對外植體消毒是在超凈工作臺上進行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養(yǎng)基中。   

植物外植體消毒和接種(以胡蘿卜為例)： 

1 ．接種前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴銨溶液擦拭超凈工作臺臺面，將培養(yǎng)基及用具放入工作臺，開超凈工作臺紫外燈照射**少20 min，然后開送風開關(guān)，之后關(guān)閉紫外燈，通風10 min后，再開日光燈進行無菌操作。 

2 ．將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織，切成小塊分別放100 mL 燒杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡2 、5 、10 min ，用無菌水洗滌3 次，無菌紙吸干水分。取出培養(yǎng)皿，剪刀和鑷子使用前插入90％乙醇溶液中，使用鑷子時在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后，切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在試管口靠近火焰旁。#p#分頁標題#e#3 ．將培養(yǎng)容器斜面向上，并使它們拉于水平位置，也可將培養(yǎng)容器放在左手中。將塞蓋用右手擰轉(zhuǎn)松動，以便接種時拔出。用火焰灼燒管口，灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動試管口（靠手腕的動作，使試管口沾染的少量菌得以燒死）。將燒過的接種針（環(huán)）觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后輕輕接觸外植體，慢慢將接種針（環(huán)）抽出試管，打開培養(yǎng)容器蓋，將外植體放在培養(yǎng)基上，每瓶放3 塊。封口，貼標簽，注明姓名，標明時間和材料名稱。整理好接種室（箱）的臺面，搞好清潔衛(wèi)生。 

4 ．用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片，用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯中，在超凈工作臺上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用無菌水洗滌3 次，將葉片切成長1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。 

5 ．綠豆種子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐溫2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期間不斷攪拌溶液，用無菌水洗滌5～6 遍，洗干種子外圍水分，按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。  

無菌操作原則： 

  一、在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。 

  二、執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。   三、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。    [無菌操作間]  

無菌操作間 

四、進行無菌操作時，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。   五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為**無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回無菌容器內(nèi)。 

  六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。 

  七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時碰在容器外面被污染。  

原則及注意事項 

無菌操作原則： 

  一、在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。   二、執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。   三、夾取無菌物品必須使用無菌持物鉗。  

  

 

無菌操作間 

四、進行無菌操作時，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。   五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為**無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回無菌容器內(nèi)。   六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。   七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時碰在容器外面被污染。  

無菌操作技術(shù)及注意事項 

1、玻璃器皿的消毒和清潔   ⑴新購玻璃器皿的處理新購玻璃器皿應(yīng)用熱肥皂水洗刷，流水沖洗，再用1%～2%鹽酸溶液浸泡，以除去游離堿，再用水沖洗。對容量較大的器皿如試劑瓶、燒瓶或量具等，經(jīng)清水洗凈后應(yīng)注入濃鹽酸少許，慢慢轉(zhuǎn)動，使鹽酸布滿容器內(nèi)壁數(shù)分鐘后傾出鹽酸，再用水沖洗。   ⑵污染玻璃器皿的處理   ①一般試管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分鐘，或在3%～5%漂白粉澄清液內(nèi)4小時，有的亦可用肥皂或合成洗滌劑洗刷使盡量產(chǎn)生泡沫，然后用清水沖洗**無肥皂為止。**后用少量蒸餾水沖洗。   ②細菌培養(yǎng)用的試管和培養(yǎng)皿可先行集中，用1kg/cm2高壓滅菌15～30分鐘，再用熱水洗滌后，用肥皂洗刷，流水沖洗。   ③吸管使用后應(yīng)集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小時，逐支用流水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗。   ④油蠟沾污的器皿，應(yīng)單獨滅菌洗滌，先將沾有油污的物質(zhì)棄去，倒置于吸水紙上，100℃烘干半小時，再用堿水煮沸，肥皂洗滌，流水沖洗。必要時可用二甲苯或汽油去油污。   ⑤染料沾污的器皿，可先用水沖洗，后用清潔或稀鹽酸洗脫染料，再用清水沖洗。一般染色劑呈堿性，所以不宜用肥皂的堿水洗滌。   ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水沖洗，再用肥皂或弱堿性煮沸，自然冷卻后，流水沖洗。被結(jié)核桿菌污染或不易洗凈的玻片，可置于清潔液內(nèi)浸泡后再沖洗。   2、無菌器材和液體的準備將玻璃器具中的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、試管、吸管等按上述方法洗凈烘干后，用一潔凈紙包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，裝入干凈的鋁盒或鐵盒中，于120℃的干燥箱中干燥滅菌2小時，取出備用。對于手術(shù)器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，則采用高壓蒸氣滅菌法，即在15磅的條件下，加熱20分鐘。而對于MEM培養(yǎng)液、小牛血清和消化液等需用G5或G6濾器負壓抽濾后使用。   3、無菌操作過程在無菌操作過程中，**重要的是要保持工作區(qū)的無菌、清潔。因此，在操作前20～30分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，并認真洗手和消毒。在操作時，嚴禁喧嘩，嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的止血鉗、鑷子等。培養(yǎng)瓶應(yīng)在超凈臺內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復用酒精燈燒。對于吸管應(yīng)先用手拿后1/3處，戴上膠皮乳頭，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。   4、常用清潔液的配制法⑴重鉻酸鉀清潔液：可根據(jù)不同需要，選用下列的任何一種濃度。先將重鉻酸鉀溶于水中，再慢慢加入濃硫酸。注意，此#p#分頁標題#e#時可產(chǎn)生高熱，應(yīng)防止容器破裂。重鉻酸鉀清潔液除污力強，腐蝕性大，應(yīng)避免接觸皮膚和衣服。為防止吸收空氣的水分而變質(zhì)，此液應(yīng)貯存于帶蓋的容器中。如清潔效力較差，可再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸，還可繼續(xù)使用。直到液體變藍綠色，即不能再用。配制重鉻酸鉀清潔液時，宜用耐高溫的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿時，應(yīng)特別注意防止產(chǎn)生高熱而破裂，切忌用量筒來配制。   ⑵磷酸三鈉將其配成5%～10%水溶液，可用于洗滌玻璃器皿上的油污，但經(jīng)常使用腐蝕玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。   ⑶硝酸清潔液將其配成50%水溶液，可用于清潔微量滴定筒。⑷乙二胺四乙酸二鈉（EDTA鈉鹽）將其配成5%～10%水溶液，可洗脫粘附于玻璃器皿內(nèi)壁的白色沉淀物。⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌粘附有血液血清等蛋白質(zhì)的吸管、試管等。  

  

無菌操作法 

2007-10-24 17:23   【大 中 小】【我要糾錯】   無菌操作法，是整個過程控制在無菌條件下進行的一種操作方法。某些藥品加熱滅菌后發(fā)生變質(zhì)、變色或降低含量者可采用無菌操作法制備。此種無菌操作，不僅用于注射劑而且對其它的如滴眼劑、海棉劑等用于粘膜和創(chuàng)傷的制劑也均適用。無菌操作室或無菌操作所用的一切用具、材料以及環(huán)境，均須應(yīng)用面所述滅菌法滅菌，操作須在無菌操作室或無操作柜內(nèi)進行。 

  （一）無菌操作的空氣滅菌可應(yīng)用上節(jié)《氣體滅菌法》中所述的甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具體用法不再贅述。藥廠大型無菌操作，常用甲醛溶液加熱熏蒸進行空氣滅菌。將甲醛溶液放入瓶內(nèi)，逐漸被吸收蒸氣夾層加熱鍋中，甲醛溶液被加熱，甲醛蒸氣經(jīng)氣出口送入總進風道，由鼓風機吹入無菌操作室，連續(xù)3小時后，一般即可將鼓風機關(guān)閉。室溫應(yīng)保持25℃以上，以免室溫過低甲醛蒸氯了聚合而附著于冷表面，濕度應(yīng)保持60％以上，密閉熏蒸12－24小時以后，再將25％氨水加熱（每m3用8－10ml），從總風道送入氨氣約15分鐘，以吸收甲醛蒸氣，然后開啟總出口排風，并通入經(jīng)處理過的無菌空氣直到室內(nèi)無臭氣為止。   除用上述方法定期進行較徹底的滅菌外，還要對室內(nèi)的空間、用具（桌椅等）、地面、墻壁等，用3％酚溶液、2％煤酚皂溶液、0.2%新潔而或75％酒精噴灑或擦試。其它用具盡量用熱壓滅菌法或干熱滅菌法滅菌。每天工作前開啟外線一小時，中午休息時間也要開1／2－1小時。 

  （二）無菌操作操作人員進入操作之前要洗澡并換上已經(jīng)滅菌的工作服和清潔的鞋子，不使頭發(fā)、內(nèi)衣等露出來，以免造成污染機會。安瓿要150－180℃2－3小時干熱滅菌。橡皮塞要以121℃1小時熱壓滅菌。有關(guān)器具、機器都要經(jīng)過滅菌。用無菌操作法制備的注射劑， 大多要加入抑制。醫(yī)學教育網(wǎng)搜集整理   小量無菌制劑的制備，也可在無菌操作柜中進行。無菌操作柜分小型無菌操作與聯(lián)合無菌無操作兩種小型無菌操作柜又稱單人無菌柜。式樣有單面式與雙面式兩種。操作柜的架子用木制，四周配以玻璃，前面操作下裝木板，挖二圓孔，孔內(nèi)密接橡皮手套或袖套。藥品及用具等，由側(cè)門送入柜內(nèi)后關(guān)閉。操作時可完全與外界空氣隔jue。柜內(nèi)空氣的滅菌，可在柜中央上方裝一小型紫外線燈，使用前1小時啟燈滅菌，或用藥液（如3％酚溶液）噴霧滅菌。聯(lián)合無菌操作柜是由幾個小型操作柜聯(lián)合制成，以使原料的精制，傳遞分裝及成品暫時存放等工作全部在柜內(nèi)進行。近年來，采用層流潔凈工作臺作無菌操作，使用方便，效果可靠。意義 

無菌是指在環(huán)境中一切有生命活動的微生物的營養(yǎng)細胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。在微生物實驗中， 操作的目的在于防止待接種細菌被雜菌污染。只有在培養(yǎng)基、實驗器皿等處于無菌的前提下，才能保證菌種不被污染。  接種細菌時，應(yīng)注意以下幾項：  

（1）在超凈工作臺上操作，工作臺在使用前要紫外消毒，酒精消毒等  （2）應(yīng)在酒精燈火焰前操作  

（3) 取菌種前灼燒接種針或接種環(huán)（要燒紅）  

（4）燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種  （5）接種后應(yīng)盡快塞上棉塞  

總之，一句話，盡可能防止雜菌污染！?。?！